Potpuno bubrenje smole
Izmeriti 2,0 g prazne Wang smole u čistoj i suvoj reakcionoj epruveti, dodati 15 mL DMF-a, aktivacija na sobnoj temperaturi oko 30 min.
Uzmite prvu aminokiselinu
Na sobnoj temperaturi, filtrirajte rastvarač iz prethodnog koraka kroz jezgro peska i dodajte 1 mmol 5 molarnog viška C Prva aminokiselina na kraju, 5-struki molarni višak DMAP, 5 molarni višak DIC, DMF Izvršite reakciju rastvarača na sobnoj temperaturi 3 h. Koristite nakon što je reakcija završena DMF Wash 4 ~6 puta, 5-6 puta svaki put mL. Zatim dodati odgovarajuću količinu piridina i anhidrida sirćetne kiseline u volumnom odnosu 1:1 i reagovati 30 min. Koristite nakon što je reakcija završena DMF Wash 4 ~6 puta, 5-6 puta svaki put mL. (efekat: Blokirajte aktivne mikrotačke na nereaktivnoj praznoj smoli.)
Fmoc Odlazak zaštitnih grupa
Uklonite otapalo iz prethodnog koraka usisnom filtracijom i dodajte 10 mL 20% piperidina DMF Otopina se dodaje smoli, N2 Miješajte 10 min Na kraju, filtrirajte otopinu i dodajte 10 mL 20% otopine piperidina DMF, N2 Duvajte i miješajte 5 min. Zatim filtrirajte otopinu i ponovite ovu operaciju dva puta. DMF Oprati 4 puta, isprati 2 puta metanolom, svaki put 5-6 puta ml.
Ispitivanje efekta uklanjanja ninhidrina
Izvadite malu količinu smole, isperite je tri puta metanolom, dodajte ninhidrin, KCN, po jednu kap rastvora fenola, 105 stepeni –110 stepeni Zagrevanje 5 min. Tamnoplava boja je pozitivna reakcija, što ukazuje da je uklanjanje završeno i da se može izvesti sledeći korak reakcije.; Ako je bezbojna, to znači da zaštitna grupa nije u potpunosti uklonjena, te je potrebno ponoviti gornju operaciju uklanjanja zaštite.
Zatim uklanjanje druge aminokiseline i Fmoc zaštitne grupe
Izvagati 3-struki molarni višak C Druga aminokiselina na kraju, 3-struki molarni višak HBTU i 3-struki molarni višak HOBT-a. U reakcionu epruvetu dodajte odgovarajuću količinu DMF-a Nakon što se rastvor potpuno otopi, dodajte 10-struki molarni višak (čistog) DIEA, Reakcija na sobnoj temperaturi 40 min, koristite DMF-vrijeme ispiranja 45 ~ 6FL puta. Uzmite malu količinu smole. Testirajte sa reagensom za detekciju ninhidrina i izgledat će bezbojno, zatim dodajte 10 mL 20% piperidin DMF otopine za uklanjanje Fmoc, Uradite ovo dva puta po 10 min, 5 min, nakon upotrebe DMF Oprati 4 puta, isprati 2 puta metanolom, 5-6 puta svaki put mL. Uklonite malu količinu smole. Koristite reagens za detekciju ninhidrina da biste je otkrili. Ako je detekcija plava, možete preći na sljedeći korak reakcije.
Po analogiji, ponavljajte korake 2.6 dok sinteza ne bude N. Uklonite posljednju aminokiselinu na kraju Fmoc Protect baze, a zatim ocijedite.
Odvajanje smole i čisto odvajanje i detekcija proizvoda
Konačno, koristite rastvor za rezanje trifluorosirćetne kiseline (95% TFA:2% TIS:2% EDT:1% H2O). Rezati 2 h, filtrirati reakcioni rastvor odsisavanjem i dobiti rastvor trifluorosirćetne kiseline polipeptida. Lizat osušiti dušikom što je više moguće, precipitirati etrom, centrifugirati, a zatim isprati etrom 3 sekunde. ~5 puta, dobijena je bijela čvrsta supstanca. Nakon što ga otopite u čistoj vodi, HPLC odsolite i pročistite, osušite{11}}liozom i precipitirate kristale, uzmite malu količinu MS analize.